آنزیم هایی که بر روی پیوند کربوکسیل استری در زهر مار اثر می کنند

زهر مار حاوی آنزیم هایی است که پیوندهای کربوکسیل استری را هیدرولیز می کند.سوبستراهای هیدرولیز فسفولیپیدها، استیل کولین و استات آروماتیک هستند.این آنزیم ها شامل سه نوع هستند: فسفولیپاز، استیل کولین استراز و استراز معطر.آرژنین استراز در زهر مار همچنین می تواند آرژنین مصنوعی یا لیزین را هیدرولیز کند، اما عمدتا پیوندهای پپتیدی پروتئینی را در طبیعت هیدرولیز می کند، بنابراین به پروتئاز تعلق دارد.آنزیم های مورد بحث در اینجا فقط بر روی بسترهای استری عمل می کنند و نمی توانند روی هیچ پیوند پپتیدی عمل کنند.در بین این آنزیم ها، عملکرد بیولوژیکی استیل کولین استراز و فسفولیپاز اهمیت بیشتری دارد و به طور کامل مورد مطالعه قرار گرفته است.برخی از سم‌های مار دارای فعالیت استراز معطر قوی هستند که می‌تواند p-nitrophenyl ethyl ester، a - یا P-naphthalene acetate و indole ethyl ester را هیدرولیز کند.هنوز مشخص نیست که آیا این فعالیت توسط یک آنزیم مستقل یا یک اثر جانبی شناخته شده کربوکسیل استراز ایجاد می شود، چه رسد به اهمیت بیولوژیکی آن.هنگامی که سم Agkistrodon halys Japonicus با p-نیتروفنیل اتیل استر و ایندول اتیل استر واکنش نشان داد، هیدرولیز p-نیتروفنول و ایندول فنل یافت نشد.برعکس، اگر این استرها با سم مار زیرگونه مار کبرا ژوشان و سم مار Bungarus multicinctus واکنش دهند، به سرعت هیدرولیز می شوند.مشخص است که این زهرهای کبری دارای فعالیت کولین استراز قوی هستند که ممکن است مسئول هیدرولیز بسترهای فوق باشد.در واقع، مکلین و همکاران.(1971) گزارش کرد که بسیاری از زهر مارهای متعلق به خانواده کبرا می توانند ایندول اتیل استر، نفتالین اتیل استر و بوتیل نفتالین استر را هیدرولیز کنند.این زهر مارها از موارد زیر می‌آیند: کبرا، کبری گردن سیاه، کبری لب سیاه، کبری طلایی، مار کبری مصری، شاه کبری، مامبای کبری طلایی، مامبای سیاه و مامبای لب سفید (D.aw هنوز مار زنگی لوزی شرقی را می‌شناسد.

زهر مار می تواند متیل ایندول اتیل استر را هیدرولیز کند، که بستری برای تعیین فعالیت کولین استراز در سرم است، اما این سم مار فعالیت کولین استراز را نشان نمی دهد.این نشان می دهد که یک استراز ناشناخته در زهر کبری وجود دارد که با کولین استراز متفاوت است.برای درک ماهیت این آنزیم، کار جداسازی بیشتری لازم است.

1، فسفولیپاز A2

(I) بررسی اجمالی

فسفولیپاز آنزیمی است که می تواند گلیسریل فسفات را هیدرولیز کند.5 نوع فسفولیپاز در طبیعت وجود دارد، فسفولیپاز A2 و فسفولیپاز.

A.، فسفولیپاز B، فسفولیپاز C و فسفولیپاز D. زهر مار عمدتاً حاوی فسفولیپاز A2 (PLA2) است، چند سم مار حاوی فسفولیپاز B، و سایر فسفولیپازها عمدتاً در بافت‌های حیوانی و باکتری‌ها یافت می‌شوند.شکل 3-11-4 محل عمل این فسفولیپازها را در هیدرولیز سوبسترا نشان می دهد.

در بین فسفولیپازها، PLA2 بیشتر مورد مطالعه قرار گرفته است.ممکن است این آنزیم مورد مطالعه ترین آنزیم در زهر مار باشد.بستر آن پیوند استری در موقعیت دوم Sn-3-گلیسروفسفات است.این آنزیم به طور گسترده در زهر مار، زهر زنبور عسل، زهر عقرب و بافت های حیوانی یافت می شود و PLA2 در زهر مارهای چهار خانواده به وفور یافت می شود.از آنجایی که این آنزیم گلبول‌های قرمز را می‌شکند و باعث همولیز می‌شود، به آن همولیزین نیز می‌گویند.برخی افراد PLA2 همولیتیک لسیتیناز را نیز می نامند.

لودیک برای اولین بار دریافت که زهر مار می تواند با اثر بر لسیتین از طریق آنزیم ها، یک ترکیب همولیتیک تولید کند.بعدها، دلزن و همکاران.ثابت کرد که وقتی زهر کبری روی سرم یا زرده اسب اثر می گذارد، یک ماده همولیتیک تشکیل می دهد.اکنون مشخص شده است که PLA2 می تواند مستقیماً بر روی فسفولیپیدهای غشای گلبول های قرمز تأثیر بگذارد و ساختار غشای گلبول قرمز را از بین ببرد و باعث همولیز مستقیم شود.همچنین می‌تواند روی سرم یا لسیتین اضافه شده برای تولید لسیتین همولیتیک، که روی گلبول‌های قرمز اثر می‌کند و همولیز غیرمستقیم ایجاد می‌کند، عمل کند.اگرچه PLA2 در چهار خانواده زهر مارها به وفور یافت می شود، اما محتوای آنزیم ها در سم مارهای مختلف کمی متفاوت است.مار زنگی (C

زهر مار فقط فعالیت ضعیف PLA2 را نشان داد.جدول 3-11-11 مقایسه فعالیت PLA2 10 سم اصلی مارهای سمی در چین را نشان می دهد.

جدول 3-11-11 مقایسه فعالیت فسفولیپاز VIII 10 سم مار در چین

زهر مار

آزادسازی چربی

اسید آلیفاتیک،

Cjumol/mg)

فعالیت همولیتیک CHU50/^ گرم * میلی لیتر)

زهر مار

اسیدهای چرب را آزاد کنید

(^raol/mg)

فعالیت همولیتیک (HU50/ftg * 1111)

ناجانجا آترا

9. 62

یازده

میکروسفال افیس

پنج نقطه یک صفر

کالیسپالاس

8. 68

دو هزار و هشتصد

gracilis

V، آکوتوس

7. 56

* *#

اوفیوفاگوس هانا

سه امتیاز هشت دو

صد و چهل

Bnugarus fasctatus

7,56

دویست و هشتاد

B. multicinctus

یک امتیاز نه شش

دویست و هشتاد

افعی یک راسلی

هفت نقطه صفر سه

تی، موکروسکواماتوس

یک امتیاز هشت پنج

سیامنسیس

T. stejnegeri

0. 97

(2) جداسازی و تطهیر

محتوای PLA2 در زهر مار زیاد است و در برابر حرارت، اسید، قلیایی و دناتوره کننده پایدار است، به طوری که به راحتی قابل تصفیه و جداسازی PLA2 است.روش متداول این است که ابتدا فیلتر ژل روی سم خام انجام شود، سپس کروماتوگرافی تبادل یونی انجام شود و مرحله بعدی می تواند تکرار شود.لازم به ذکر است که خشک کردن انجمادی PLA2 پس از کروماتوگرافی تبادل یونی نباید باعث تجمع شود، زیرا فرآیند خشک کردن انجمادی اغلب باعث افزایش قدرت یونی در سیستم می شود که عامل مهمی در ایجاد تجمع PLA2 است.علاوه بر روش های کلی فوق، روش های زیر نیز اتخاذ شده است: ① ولز و همکاران.② آنالوگ بستر PLA2 به عنوان لیگاند برای کروماتوگرافی میل ترکیبی استفاده شد.این لیگاند می تواند با Ca2+ به PLA2 در سم مار متصل شود.EDTA بیشتر به عنوان شوینده استفاده می شود.پس از حذف Ca2+، میل ترکیبی بین PLA2 و لیگاند کاهش می یابد و می توان آن را از لیگاند جدا کرد.برخی دیگر از محلول آلی 30٪ یا 6mol/L اوره به عنوان شوینده استفاده می کنند.③ کروماتوگرافی آبگریز با PheiylSephar0SeCL-4B برای حذف رد PLA2 در کاردیوتوکسین انجام شد.④ آنتی بادی ضد PLA2 به عنوان لیگاند برای انجام کروماتوگرافی میل ترکیبی روی PLA2 استفاده شد.

تاکنون تعداد زیادی سم مار PLAZ خالص سازی شده است.تو و همکاران(1977) PLA2 را که قبل از سال 1975 از سم مار خالص شده بود، فهرست کرد. در سالهای اخیر، تعداد زیادی مقاله در مورد جداسازی و خالص سازی PLA2 هر ساله گزارش شده است.در اینجا، ما بر جداسازی و خالص سازی PLA توسط دانشمندان چینی تمرکز می کنیم.

چن یوانکونگ و همکاران(1981) سه گونه PLA2 را از سم Agkistrodon halys Pallas در ژجیانگ جدا کرد که می توان آنها را با توجه به نقاط ایزوالکتریک به PLA2 اسیدی، خنثی و قلیایی تقسیم کرد.با توجه به سمیت آن، PLA2 خنثی سمی تر است که به عنوان نوروتوکسین پیش سیناپسی Agkistrodotoxin شناخته شده است.PLA2 قلیایی سمی کمتری دارد و PLA2 اسیدی تقریباً هیچ سمیتی ندارد.وو شیانگفو و همکاران(1984) خصوصیات سه PLA2 شامل وزن مولکولی، ترکیب اسید آمینه، ترمینال N، نقطه ایزوالکتریک، پایداری حرارتی، فعالیت آنزیم، سمیت و فعالیت همولیتیک را مقایسه کردند.نتایج نشان داد که وزن مولکولی و پایداری حرارتی مشابهی داشتند، اما از جنبه‌های دیگر تفاوت معنی‌داری داشتند.از نظر فعالیت آنزیم، فعالیت آنزیم اسیدی بیشتر از فعالیت آنزیم قلیایی بود.اثر همولیتیک آنزیم قلیایی بر گلبول‌های قرمز موش قوی‌ترین بود، پس از آن آنزیم خنثی، و آنزیم اسیدی به سختی همولیز شد.بنابراین، حدس زده می شود که اثر همولیتیک PLAZ مربوط به بار مولکول PLA2 است.ژانگ جینگ کانگ و همکاران(1981) بلورهای Agkistrodotoxin ساخته اند.تو گوانگلیانگ و همکاران(1983) گزارش داد که یک PLA سمی با نقطه ایزوالکتریک 7.6 از سم Vipera rotundus از فوجیان و خواص فیزیکی و شیمیایی آن، ترکیب اسید آمینه و دنباله 22 باقیمانده اسید آمینه در N جدا و خالص شد. ترمینال تعیین شد.لی یوشنگ و همکاران(1985) PLA2 دیگری را از سم افعی rotundus در فوجیان جدا و خالص کرد.زیرواحد PLA2 * 13 800، نقطه ایزوالکتریک 10.4 و فعالیت ویژه 35/xnioI/miri mg است. با لسیتین به عنوان بستر، pH بهینه آنزیم 8.0 و دمای مطلوب 65 درجه سانتیگراد است. LD5 به صورت داخل وریدی در موش تزریق شد.0.5 ± 0.12 میلی گرم بر کیلوگرم است.این آنزیم دارای اثرات ضد انعقادی و همولیتیک آشکار است.مولکول سمی PLA2 از 123 باقیمانده از 18 نوع اسید آمینه تشکیل شده است.این مولکول سرشار از سیستئین (14)، اسید آسپارتیک (14) و گلیسین (12) است، اما تنها حاوی یک متیونین است و N-ترمینال آن باقیمانده سرین است.در مقایسه با PLA2 جدا شده توسط Tuguang، وزن مولکولی و تعداد بقایای اسید آمینه دو ایزوآنزیم بسیار مشابه است و ترکیب اسید آمینه نیز بسیار مشابه است، اما تعداد باقی مانده های اسید آسپارتیک و پرولین تا حدودی متفاوت است.سم مار مار کبری گوانگشی دارای PLA2 غنی است.شو یویان و همکاران(1989) یک PLA2 را از زهر جدا کرد که دارای فعالیت ویژه 3.6 برابر بیشتر از زهر اصلی، وزن مولکولی 13000، ترکیبی از 122 باقیمانده اسید آمینه، نقطه ایزوالکتریک 8.9 و پایداری حرارتی خوب است.با مشاهده میکروسکوپ الکترونی اثر PLA2 پایه بر گلبول‌های قرمز خون، می‌توان دریافت که تأثیر آشکاری بر غشای گلبول قرمز انسان دارد، اما تأثیر آشکاری بر گلبول‌های قرمز خون بز ندارد.این PLA2 اثر تاخیری آشکاری بر سرعت الکتروفورتیک گلبول های قرمز در انسان، بز، خرگوش و خوکچه هندی دارد.چن و همکاراناین آنزیم می تواند تجمع پلاکتی ناشی از ADP، کلاژن و سدیم آراشیدونیک اسید را مهار کند.وقتی غلظت PLA2 10/xg/ml~lOOjug/ml باشد، تجمع پلاکتی کاملاً مهار می‌شود.اگر پلاکت های شسته شده به عنوان مواد استفاده می شد، PLA2 نمی تواند تجمع در غلظت 20Mg/ml را مهار کند.آسپرین یک مهارکننده سیکلواکسیژناز است که می تواند اثر PLA2 را بر پلاکت ها مهار کند.PLA2 ممکن است با هیدرولیز اسید آراشیدونیک برای سنتز ترومبوکسان A2 از تجمع پلاکتی جلوگیری کند.ترکیب محلول PLA2 تولید شده توسط سم Agkistrodon halys Pallas در استان ژجیانگ با استفاده از دو رنگی دایره ای، فلورسانس و جذب UV مورد مطالعه قرار گرفت.نتایج تجربی نشان داد که چینش زنجیره اصلی این آنزیم مشابه همان آنزیم از گونه‌ها و جنس‌های دیگر است، ساختار اسکلت مقاومت حرارتی خوبی دارد و تغییر ساختاری در محیط اسیدی قابل برگشت است.ترکیب فعال کننده Ca2+ و آنزیم بر محیط باقیمانده تریپتوفان تأثیر نمی گذارد، در حالی که مهارکننده Zn2+ برعکس این کار را انجام می دهد.روشی که مقدار pH محلول بر فعالیت آنزیم تأثیر می گذارد با معرف های فوق متفاوت است.

در فرآیند تصفیه PLA2 از سم مار، یک پدیده آشکار این است که یک سم مار حاوی دو یا چند قله شستشوی PLA2 است.این پدیده را می توان به صورت زیر توضیح داد: ① به دلیل وجود ایزوآنزیم ها.② یک نوع PLA2 به انواع مخلوط های PLA2 با وزن های مولکولی مختلف پلیمریزه می شود که اکثر آنها در محدوده 9000 تا 40000 قرار دارند.③ ترکیب PLA2 و سایر اجزای سم مار، PLA2 را پیچیده می کند.④ چون پیوند آمیدی در PLA2 هیدرولیز می شود، بار تغییر می کند.① و ② معمول هستند، تنها با چند استثنا، مانند PLA2 در سم مار CrWa/w

دو حالت وجود دارد: ① و ②.حالت سوم در PLA2 در سم مارهای زیر یافت شده است: Oxyranus scutellatus، Parademansia microlepidota، Bothrops a ^>er، افعی فلسطینی، افعی شنی، و مار زنگی وحشتناک کیلومتر.

نتیجه مورد ④ باعث می شود سرعت مهاجرت PLA2 در طول الکتروفورز تغییر کند، اما ترکیب اسید آمینه تغییر نمی کند.پپتیدها را می توان با هیدرولیز شکست، اما به طور کلی آنها هنوز هم توسط پیوندهای دی سولفیدی به یکدیگر متصل هستند.سم مار زنگی گودال شرقی حاوی دو شکل PLA2 است که به ترتیب نوع a و نوع p PLA2 نامیده می شوند.تفاوت این دو نوع PLA2 تنها در یک اسید آمینه است، یعنی گلوتامین در یک مولکول PLA2 با اسید گلوتامیک در مولکول دیگر PLA2 جایگزین می شود.اگرچه دلیل دقیق این تفاوت مشخص نیست، اما عموماً اعتقاد بر این است که مربوط به دآمیناسیون PLA2 است.اگر PLA2 در زهر افعی فلسطینی با سم خام گرم نگه داشته شود، گروه های انتهایی در مولکول های آنزیمی آن بیشتر از قبل می شوند.از C PLA2 جدا شده از زهر مار دارای دو ترمینال N متفاوت است و وزن مولکولی آن 30000 است. این پدیده ممکن است ناشی از دایمر نامتقارن PLA2 باشد که شبیه دایمر متقارن تشکیل شده توسط PLA2 در سم مار زنگی الماسی شرقی است. و مار زنگی پشت الماس غربی.کبرای آسیایی از زیرگونه های زیادی تشکیل شده است که برخی از آنها در طبقه بندی چندان مشخص نیستند.به عنوان مثال، آنچه قبلاً زیرگونه کبرا بیرونی خزر نامیده می شد، اکنون شناخته شده است

باید آن را به کبری خارجی دریای خزر نسبت داد.از آنجایی که زیرگونه های زیادی وجود دارد و با هم مخلوط می شوند، ترکیب زهر مار به دلیل منابع مختلف بسیار متفاوت است و محتوای ایزوآنزیم های PLA2 نیز زیاد است.مثلا زهر کبری

حداقل 9 نوع ایزوآنزیم PLA2 از گونه های r ^ ll در و 7 نوع ایزوآنزیم PLA2 در زهر زیرگونه کبری خزر یافت شد.دورکین و همکاران(1981) محتوای PLA2 و تعداد ایزوآنزیم‌ها را در سم‌های مختلف مار، از جمله 18 سم مار کبری، 3 سم مامبا، 5 سم افعی، 16 سم مار زنگی و 3 سم مار دریایی مورد مطالعه قرار دادند.به طور کلی، فعالیت PLA2 زهر کبری بالا است و ایزوآنزیم های زیادی دارد.فعالیت PLA2 و ایزوآنزیم های زهر افعی متوسط ​​است.فعالیت PLA2 سم مامبا و زهر مار زنگی بسیار کم یا بدون فعالیت PLA2 است.فعالیت PLA2 سم مار دریایی نیز کم است.

در سال های اخیر گزارش نشده است که PLA2 در زهر مار به شکل دایمر فعال مانند مار زنگی رومبوفورای شرقی وجود داشته باشد (زهر مار C. حاوی نوع a و PLA2 است که هر دو از دو زیر واحد یکسان تشکیل شده اند. ، و فقط دایمراز دارد

فعالیت.شن و همکارانهمچنین پیشنهاد کرد که فقط دایمر PLA2 زهر مار شکل فعال آنزیم است.مطالعه ساختار فضایی نیز ثابت می کند که PLA2 مار زنگی غربی پشت الماسی به شکل دایمر وجود دارد.ترکیب ماهی خوار

دو PLA ^ Ei و E2 مختلف از سم مار وجود دارد که در آنها 仏 به شکل دایمر وجود دارد، دایمر فعال است و مونومر جدا شده آن غیرفعال است.لو ینگهوا و همکاران(1980) به بررسی بیشتر خواص فیزیکی و شیمیایی و سینتیک واکنش E. Jayanthi و همکاران پرداخت.(1989) یک PLA2 اساسی (VRVPL-V) را از زهر افعی جدا کرد.وزن مولکولی مونومر PLA2 10000 است که دارای اثرات کشنده، ضد انعقاد و ادم است.این آنزیم می تواند پلیمرهایی با وزن مولکولی متفاوت را تحت شرایط PH 4.8 پلیمریزه کند و با افزایش دما درجه پلیمریزاسیون و وزن مولکولی پلیمرها افزایش می یابد.وزن مولکولی پلیمر تولید شده در دمای 96 درجه سانتیگراد 53 100 است و فعالیت PLA2 این پلیمر 2 برابر افزایش می یابد.